Práctica:Transformación bacteriana Fecha: 17/10/2019
Elaboró:
García López Mayte
Valenzuela Guzmán María del Pilar
Resultados
Se realizó una transformación en E. coli W3110 utilizando un plásmido que codifica
para la resistencia a ampicilina y la producción de proteínas GFP, para eso primero
se realizó la obtención de células electrocompetentes, después se realizó la
electrotransformación. Posteriormente, se verificó las características de la cepa
E. coli W3110 ampR gfp+ y se inoculó en agar Mac Conkey, agar BHI y agar luria+AMP.
Al final, se realizó una electroforesis.
Figura 1. E. coli con plásmido en agar TSA bajo luz UV, del equipo 4.
Figura 2. E. coli con plásmido en agar Mac Conkey.
Figura 3. E. coli con plásmido en agar BHI.
Figura 4 y 5. E.coli con plásmido en agar luria + AMP, bajo luz UV.
Figura 6. Control Salmonella typhimorium PF430 (ampR, gfp+), microscopio de fluorescencia.
Figura 7. Resultado de la cámara de electroforesis.
Figura 8. Marcador de peso molecular O’ Gene Ruler 1Kbp.
Consultado en: https://bit.ly/2IWZRdQ
Diagramas de flujo de trabajo
* El frotis no se logró observar en el microscopio de fluorescencia.
Conclusiones
En la naturaleza el ADN es transferido entre bacterias utilizando 2 métodos:
transformación y conjugación. En la transformación, una bacteria adquiere DNA
exógeno del ambiente. En contraste, la conjugación requiere el contacto directo entre
dos bacterias, un trozo de ADN es copiado en una célula (donante) y luego es
transferido a otra célula (receptor). En ambos casos, la bacteria adquiere nueva
información genética que es estable y heredable. Muchas bacterias poseen genes no
esenciales en pequeñas piezas circulares de doble cadena de ADN, además
de su ADN cromosómico. Estas piezas de ADN, llamadas plásmidos, permiten a
las bacterias intercambiar beneficios. Por ejemplo, el gen que codifica para la
- lactamasa, un enzima que proporciona resistencia a los antibióticos puede estar
codificado en plásmidos. Células transformadas secretan -lactamasa en el medio
proporcionando resistencia al antibiótico ampicilina. De este modo, las bacterias que
expresan este gen pueden crecer en presencia de ampicilina. Además, pequeñas
colonias satélites no transformadas pueden crecer alrededor de las bacterias
transformadas porque indirectamente son protegidas por la actividad -lactamasa.
La tecnología del ADN recombinante permite a los científicos colocar genes de
diferentes orígenes en los plásmidos bacterianos.
La fluorescencia proviene de las proteínas verdes y azules codificadas por
los respectivos plásmidos.
Células de E.coli pueden ser inducidas a ser competentes cuando son tratadas
con sales de cloruros de los cationes calcio y magnesio. Además, ciclos repetitivos
de calor y frío pueden ayudar a convertirse en competentes. Los metales iónicos y
los cambios de temperatura afectan la estructura y permeabilidad de la pared celular
y membrana de modo que las moléculas de ADN extracelular pueden pasar, además
que al estar en el citoplasma no debe ser degradado y el genoma bacteriano debe
poseer genes codificantes de proteínas que ayuden a captar el material genético
extracelular [1].
Al terminar la electrotransformación se inoculó en medio TSA y agar sangre, y se
reveló bajo luz UV (figura 1), sin embargo, en agar sangre no era visible la fluorescencia.
De acuerdo a la bibliografía, en agar Mac Conkey [2] es un medio de diferenciación
selectivo para el aislamiento y la diferenciación de Enterobacteriaceae y diversos otros
bacilos gram negativos, en la figura 2 se muestran colonias pequeñas de color de
rosa lo que concuerda con la capacidad de E. coli para fermentar carbohidratos
(fermentador de lactosa), también se observa un pequeño halo de precipitación biliar.
El agar BHI es es un medio de uso general adecuado para el cultivo de una amplia
variedad de tipos de organismos, incluidos las bacterias, levaduras y hongos
filamentosos, a partir de muestras clínicas, obtiene los nutrientes de la infusión
de cerebro y corazón, la peptona y la glucosa. Las peptonas y la infusión son fuentes
de nitrógeno orgánico, carbono, azufre, vitaminas y sustancias de traza [3]; en la
figura 3 se muestra crecimiento pequeño de color ámbar claro y no se observa una
morfología colonial definida. En el agar Luria + AMP (ampicilina), figura 4 y 5 se
observa un pequeño crecimiento de color blanco que que presenta fluorescencia bajo
la exposición de luz UV, con base en esto se puede asegurar que la transformación
bacteriana fue exitosa, ya que este crecimiento corresponde a las células
transformadas que codifican para la resistencia a ampicilina (utilizando un plásmido
que codifica para la proteína verde fluorescente), lo cual le permite a E. coli W3110
ampR gfp+ crecer en este medio.
La electroforesis es un método de separación basado en la movilidad de las biomoléculas
en una fase líquida sometida a un campo eléctrico. Las moléculas que posean carga
negativa migrarán hacia el polo positivo de un aparato electroforético y viceversa. [4]
Ya que los ácidos nucleicos en el DNA están cargados de manera uniforme negativamente
porque existen estas cargas en el esqueleto de fosfato; se podrá ver la movilidad del polo
negativo, al polo positivo. Lo que determina cuánto migra en el gel, depende de cuan
pequeño es, por lo tanto, los fragmentos de DNA de mayor tamaño migrarán una distancia
menor que los que sean de mayor tamaño; para determinar el tamaño del DNA,
se utilizan marcadores de peso molecular.
Con el resultado de la cámara de electroforesis, se puede distinguir de manera más
coloreada una marca, más cercana al polo negativo, indicando que el DNA no pudo migrar
una gran distancia, porque las moléculas de DNA son de gran tamaño. De acuerdo al
marcado de peso molecular O’ Gene Ruler 1 Kbp, podría corresponder a una cantidad
de pares de bases alto, y ya que el plásmido utilizado (pBABE-GFP) tiene un peso
molecular de 5,169 bp, se puede concluir que el resultado es corresponde a este DNA
plasmídico.
Bibliografía
[1] DanaGen-BioTed S.L. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA CON PROTEÍNAS
FLUORESCENTES VERDES Recuperado el 15 de octubre de 2019 de la página web:
[2]Becton Dickinson GmbH (2014). BD MacConkey II Agar. Recuperado el 15 de
octubre de 2019 de la página web: https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8770
[3] Becton Dickinson GmbH (2013). BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar.
Recuperado el 15 de octubre de 2019 de la página web: https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8800
[4] PENA-CASTRO, Julián M.; GREGORIO-RAMIREZ, Oscar y
BARRERA-FIGUEROA, Blanca E. Los métodos experimentales que permiten el estudio de las macromoléculas de la vida: historia, fundamentos y perspectivas. Educ. quím [online]. 2013, vol.24, n.2 [citado 2019-10-16], pp.237-246.
Disponible en: <http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-893X2013000200009&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0187-893X.
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