12/11/2019
PRÁCTICA: TÉCNICAS PARA LA ENUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS
Elaboró:
García López Mayte
Valenzuela Guzmán María del Pilar
RESULTADOS
Método del Número Más Probable (NMP): Cuantificación de coliformes totales y
fecales
Se utilizó la técnica de NMP para cuantificar los coliformes totales y los coliformes fecales en una muestra de agua purificada de la marca Member’s Mark, si había presencia de ellos; mediante una prueba presuntiva para detectar microorganismos coliformes con caldo lactosa doble concentración y pruebas confirmativas, para coliformes totales con caldo de bilis verde brillante y para coliformes fecales con caldo EC. Se incubar los tubos a 35 ± 0,5°C y se examinaron los tubos a las 24 h, para todas las pruebas.
Prueba presuntiva:
Figura 1. Tubos con caldo lactosado doble concentración con agua purificada.
Prueba confirmativa para coliformes totales:
Figura 2. Resultado de prueba en tubos con caldo de bilis verde brillante.
Prueba confirmativa para coliformes fecales:
Figura 3. Resultado de prueba con caldo EC.
Tabla 1. NMP de organismos coliformes por 100 mL de muestra.
CCAYAC-M-004 (2006). Estimación de la densidad microbiana por la técnica del NMP, detección de coliformes totales y coliformes fecales y E. coli por NMP (COFEPRIS).
De acuerdo a los resultados observados, todos los tubos de todas las pruebas resultaron negativos, lo que indica que el NMP era < 1.1/100 mL o no había presencia de coliformes por ende tampoco de coliformes fecales.
Se compararon los resultados con otros casos donde las pruebas fueron positivas:
- Todas las pruebas positivas (Equipo 5)
Figura 4, 5 y 6. Pruebas con caldo lactosado doble concentración, con caldo de bilis verde
brillante y con caldo EC, en orden de izquierda a derecha.
Se observa turbidez y producción de gas en todos los tubos con caldo lactosado doble concentración, al igual que en todos los tubos con caldo de bilis verde brillante, mientras que en uno de los cinco tubos con caldo EC, solo cuatro de ellos son positivos. De acuerdo a esto se puede concluir que la muestra de de agua contiene microorganismos coliformes, que incluyen coliformes fecales. De acuerdo a la tabla de NMP y con los tubos positivos con caldo lactosado doble concentración, el NMP de organismos coliformes es >8.0/100 mL.
- Dos pruebas positivas (Equipo 10)
Figura 7, 8 y 9. Pruebas con caldo lactosado doble concentración, con caldo de bilis
verde brillante y con caldo EC, en orden de izquierda a derecha.
Se observa turbidez y producción de gas en todos los tubos con caldo lactosado doble concentración, al igual que en todos los tubos con caldo de bilis verde brillante, pero todos los tubos con caldo EC dieron resultados negativos. Por lo que a mientra de agua presenta microorganismos coliformes pero no coliformes fecales. De acuerdo a la tabla de NMP y con los tubos positivos con caldo lactosado doble concentración, el NMP de organismos coliformes es >8.0/100 mL.
Método de Filtración y Siembra en Placa: Cuantificación de Coliformes
Para la técnica de filtración se utilizó el equipo Millipore y 100 mL de una muestra de agua de la marca Member’s Mark. La membrana con la que se filtró, se incubó en una placa de agar ENDO y Cetrimida, se buscaba la presencia de colonias típicas de coliformes en el agar ENDO,que son colonias de color rojo oscuro con brillo metálico y también no coliformes, que son colonias sin brillo, que pueden ser rosas, rojas, blancas o incoloras; mientras que en el agar Cetrimida se buscaban pseudomonas aeruginosa, que son colonias que están rodeadas de pigmentos azul-verdoso y presentan fluorescencia a la luz ultravioleta.
Figura 10. Resultado de la filtración en placa de agar ENDO.
Figura 11. Resultados de la filtración en placa con agar cetrimida.
Técnicas de cuenta directa: Método de Breed y Método Redox.
Para el método de Breed, se calculó el factor microscópico (FM), pero primero en un portaobjetos con un área de 1 cm2 se colocó una muestra de vino y se tiñó con azul de metileno, se observaron 5 campos y se sacó el promedio para poder obtener el FM, aunque no se pudieron observar las levaduras esperadas, ya que la muestra de vino necesitaba más tiempo.
Para el método REDOX (reducción del azul de metileno), se utilizaron dos muestras de leche distintas, una de leche bronca sin hervir y otra de leche ultrapasteurizada de la marca Alpura. Los tubos con 10 mL de leche con azul de metileno se colocaron en un baño maría a 37 ºC.
Tabla 2. Clasificación de la calidad de leche y número de microorganismos, mediante la técnica
de reducción del azul de metileno.
La leche bronca perdió la coloración azul en menos de media hora, por lo que se puede clasificar la calidad de esta muestra como muy mala, con un número de microorganismos > de 20 millones/mL. En cambio la muestra de leche ultrapasteurizada de marca Alpura, al pasar aproximadamente dos horas, no perdió la coloración, lo que indica que es de buena calidad y podría presentar un número de microorganismo de 500,000 a 4,000,000/mL. Esta lectura no es confiable o se puede considerar como correcta ya que se necesitaba más tiempo para hacerla y la calidad podría ser excelente si hubiera sobrepasado las 5.5 horas.
DILUCIÓN Y CUENTA EN PLACA
Se determinó la cantidad de microorganismos viables, por medio del método de dilución y cuenta en placa, a partir de una muestra de Yakult de 1 mL, que indica que contiene 10 mil millones Lactobacillus casei Shirota por 100 ml refrigerado (6,5 mil millones por botella). Se llevaron a cabo diluciones en serie hasta un intervalo de concentración en el cuál podía ser posible contar las colonias (10-5, 10-6 y 10-7) presentes cultivadas en un medio de cultivo MRS. Los microorganismos se contaron en la caja de petri con la dilución de 10-7 y se determinó la concentración de microorganismos en nuestra muestra inicial considerando las diluciones que se hicieron.
Figura 12. Placa con medio MRS, con la diluciòn de Yakult de 10-7.
Tabla 3. Resultados de conteos de UFC en la dilución de Yakult de 10-7.
TURBIDIMETRÍA
Tabla 4. Lectura de 8 tubos en el espectrofotómetro para la curva de calibración
Figura 13. Curva de calibración realizada con los datos de la tabla 4.
Tabla 5. Interpolación de resultados del laboratorio.
Figura 14. Curva de crecimiento a partir de la interpolación de 7 lecturas al paso
de 3.5 horas.
Tabla 6. Relación de lecturas de transmitancia con [E. coli]
Figura 15. Curva de crecimiento con relación a la transmitancia.
Determinación del número de generaciones: Considerando que la fase log ocurrió desde
el tiempo 0.5 h hasta 2 horas.
Determinación del tiempo de generación:
DIAGRAMAS DE FLUJO DE TRABAJO
CONCLUSIONES
El método utilizado con más frecuencia para la medición de poblaciones bacterianas es el recuento en placa. Una ventaja importante de esta técnica es que mide el número de células viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24 horas o más, para que se formen colonias visibles. Esto puede plantear un problema grave en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es posible mantener un lote modificado durante tanto tiempo. El recuento en placa se basa en la suposición de que cada bacteria crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no
siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas o como grumos. Por lo general, a menudo una colonia no se produce como resultado de una únicabacteria sino de segmentos cortos de una cadena o dc un agregado bacteriano. Este método lleva a hacer el banco de diluciones seriadas que no son más que un tipo de diluciones sucesivas que mantienen constante el factor de dilución en cada paso.
La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología microbiana y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto benéfico o identificar el microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino también es importante saber el número de microorganismos implicados, para establecer si los sensores afectados pueden desarrollar una función benéfica o perjudicial.
Para el conteo por filtración, las colonias bacterianas formadas por este método sondistintivas cuando ocupan un medio diferencial. Este método es modificado en la detección y enumeración de bacterias coliformes, los cuales son indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua. El Método del número más probable (NMP) es una técnica de evaluación estadística basada en el hecho de que un número mayor de bacterias en una muestra, muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de células. Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contactadas no crecerán en medios sólidos, como en el caso de las bacterias nitrificantes quimioautótrofas.Para el método REDOX las células pueden contarse en un frote teñido, usando colorantes reducidos por las bacterias (azul de metileno); al reducirse cambian de color y esto es medible. Como no es práctico recorrer todo el área, se cuenta el número de células en unos pocos campos microscópicos seleccionados al azar. Este método es susceptible a muchas críticas debido a su falta de uniformidad al momento de hacer el frote.
En método de turbidez se utiliza un instrumento para medir la turbiedad, espectrofotómetro (colorímetro). En el espectrofotómetro, un haz de luz es transmitido a través de la suspensión bacteriana, un detector sensible a la luz. Mientras aumenta el número de bacterias, menor será la luz captada por el detector. Este cambio en la luz se registrará en la escala del instrumento como el porcentaje de transmisión. También se registra una expresión logarítmica llamada absorbancia (algunas veces nombrada densidad óptica), un valor derivado del porcentaje de transmisión que puede ser reportado. Más de un millón de células por mililitro deben estar presentes para la primera señal de turbidez del mar visible. Aproximadamente de 10 millones a 100 millones de células por mililitro son necesitadas para hacer una suspensión suficientemente turbia para leer en el espectrofotómetro. La turbidez no es útil para medir la contaminación en líquidos por la pequeña cantidad relativa de bacterias.
BIBLIOGRAFÍA
Tortora, GJ y col. (2007) Introducción a la microbiología, Médica Panamericana.
Www3.uah.es. (2018) Diluciones seriadas | cuaderno de laboratorio. Disponible
en: http://www3.uah.es/cuadernolab/p/index.php/diluciones-seriadas/ [Consultado el
9 de noviembre del 2019].
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